آنتی بیوگرام

[Doctor]

بررسی حساسیت باکتری نسبت به آنتی بیوتیک ها

اریترومایسن ، پنی سیلین ، سولفونامید ، تتراسایکلین ، ونکومایسین و .... جز دسته ای بزرگ از ترکیبات شیمیایی هستند که باعث متوقف کردن رشد باکتریها (باکتریواستاتیک) و یا از بین بردن باکتری ها (باکتریوسیدال) در یک دوز پایین می شوند . در علم میکروب شناسی به این دسته از دارو ها که بروی باکتری ها اثر می گذارند آنتی بیوتیک می گویند . هر دسته از انتی بوتیک ها بر روی باکتری خاصی تاثیر دارد و این دارو ها بر روی ویروس و یا سایر میکروارگانیسم ها تاثیری نخواهند داشت ...

با این حرفا ، این سوال در ذهن ایجاد می شود که ما از کجا بدانیم چه آنتی بیوتیکی بر روی چه باکتری هایی موثر است ؟ جواب سوال ما تست آنتی بیوگرام است که به صورت روتین در آزمایشگاه های میکروبیولوژِی انجام می گیرد . این تست به ما نشان می دهد که کدام یک از آنتی بیوتیک ها بر روی میکروب ما موثر است . همانطور که می دانید نمونه های گرفته شده برای بخش میکروبیولوژِی متفاوت هستند . اما نمونه ها هر چی که باشند (خون ، مایع مغزی-نخائی ، مدفوع ، ادرار ، خلط و..) در آخر معمولا آنتی بیوگرام می شوند تا داروی موثر تجویز شود . در واقع باید بگوئیم که در عفونت های میکروبی آزمایشگاه دارو را تجویز می کند نه پزشک ...
خلاصه ای از پروسه آنتی بیوگرام دیسک دیفیوژن

بعد از کشت نمونه دریافتی در محیط کشت مناسب ، اگر شرایط مناسب باشد و باکتری در نمونه ما باشد ، باکتری موجود در نمونه رشد خواهد کرد . بعد از رشد باکتری ، از ان لام (مقداری نمونه + سرم فیزیولوژِی) تهیه می کنیم و رنگ آمیزی گرم انجام می دهیم . اگر باکتری ایزوله ما ، جز باکتری های پاتوژن باشد ، باید تست آنتی بیوگرام را انجام دهیم . مقداری از نمونه را برداشته و در محیط کشت آنتی بیوگرام کشت می دهیم ، سپس دیسک های آنتی بیوگرامی را روی محیط کشت گذاشته و جواب را بعد از ۲۴ ساعت برسی کرده و نتایج را گزارش می کنیم .

[Doctor]

اصول آنتی بیوگرام

اصول آنتی بیوگرام بر پایه دو اصطلاح میکروب شناسی است یعنی :

Minimum Inihibitory Concentration (MIC)
Minimum Bactericidal Concentration (MBC )

منظور از MIC ، غلظتی از یک آنتی بیوتیک است که می تواند رشد باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند. و منظور از MBC ، حداقل غلظتی از دارو است که باکتری را از بین می برد. در اغاز باید بگم که باید آزمایش کننده چهار اصل زیر را قبل از آغاز آنتی بیوگرام مشخص کند :

Which organisms to test?کدام ارگانیسم برای تست
What methods to use?کدام روش تست
What antibiotics to test?کدام آنتی بوتیک
How to report results? چگونگی گزارش نتایج

روش های مختلف انجام تست تعیین حساسیت داروئی

Disk diffusion (Kirby Bauer)
Broth micro-dilution MIC (NCCLS متد رفرنس)
Etest

وسائل و موارد مورد نیاز برای تست انتی بیوگرام "دیسک دیفیوژن"

محیط کشت که آنتی بیوگرام بر روی آن انجام می شود که "آگار مولر هینتون"می باشد .
لوله حاوی نیم مک فارلند .
لوله حاوی یک سی سی سرم فیزیولوژِی استریل
دیسک های انتی بیوگرام
باکتری خالص در محیط کشت مناسب
سواب ، انس ، شعله ، هود ، چراغ

محیط نیم مک فارلند

محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با ان مقایسه می کنیم . این محیط حاوی ۱.۵*۱۰۸ باکتری است . نحوه تهیه این محیط در آزمایشگاه به شرح زیر است :
روش تهیه محیط نیم مک فارلند

این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظرف در بسته که به وسیله اتش بسته شده است می تواند مورد استفاده قرار گیرد . اما با این اوصاف ، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد ، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود . زمانی که می خواهیم از این محیط استفاده کنیم باید انرا به خوبی حل بزنیم و جهت مقایسه کدورت لوله کشت با لوله مک فارلند، استفاده از یک زمینه سفید با خطوط سیاه و نور کافی توصیه می‌شود این اقدام بویژه جهت باکتریهایی مثل هموفیلوس، گنوکک و پنوموکک که در محیط آبگوشت به خوبی رشد نمی‌کنند توصیه می‌شود.

[Doctor]

روش کار

روش های مختلفی برای تعیین حساسیت باکتری ها به انتی بیوتیک ها وجود دارد اما من در این قسمت تست روتین و ساده دیسک دیفیوژن (Disk diffusion ) را معرفی می کنم .

بعد از ایزوله کردن باکتری ، مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس (نه لوپ) برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم . باید در نظر داشت که چون ، در تست آنتی بیوگرام میزان کدر بودن برای ما خیلی مهم است ، بنابراین در انتخاب مقدار نمونه باید دقت کنیم تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداریم . اگر میزان کدورت کمتر از نیم مکفارلند باشد ، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم و یا اگر میزان کدر بودن ، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند برسیم . بعد از تهیه محلول هموژن خود ، با سواب استریل محلول را به هم زده و بعد از آبکشی کردن سواب ، (برای آب کشی ، سواب را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب آن گرفته شود .) آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال می دهیم و به طور کامل به وسیله سواب ، محیط کشت را به صورت چمنی کشت می دهیم به طوری که هیچ محلی در محیط از قلم نیافتد . بعد از کشت ، دیسک های انتی بیوگرام که قبل از نیم ساعت از تست ، بیرون یخچال قرار داده شده اند را انتخاب و بر روی محیط کشت انتقال می دهیم . باید ذکر کنم که نحوه قرار دادن دیسک ها در محیط کشت مولر هینتون ، به صورت دایره ای است و فاصله این دیسک ها از هم دیگر حدود 12 میلیمتر باشد و باید از دیواره هم فاصله داشته باشند . در ضمن فاصله این دیسک ها را می توان با توجه به تجربه خود کم و یا زیاد کنیم . دیسک های مورد استفاده هم باید با نوع باکتری ایزوله شده ما مناسب باشد مثلا هیچ وقت برای باکتری گرم منفی ، پنی سیلین قرار نمی دهیم چون نسبت به آن مقاوم هستند و یا اینکه آنتی بیوتیک کلروامفینیکل را برای کشت ادرار قرار نمی دهیم چون این انتی بیوتیک نمی تواند وارد مجاری ادراری شود و... بعد از قرار دادن دیسک ها ، در پلیت را بسته و به مدت 24 ساعت آنها را در دمای 37 درجه سانتیگراد ، انکوبه می کنیم (لازم به ذکر است که بنابه به تحقیقات تازه محقین ، دمای انکوبه برای آنتی بیوگرام به ۳۵ درجه کاهش یافته است و مدت زمان آن هم به ۱۶ تا ۱۸ ساعت کاهش یافته است ) . بعد از 24 ساعت پلیت را زیر چراغ برسی می کنیم .آنگاه می‌باید قطر هاله عدم رشد را با خط‌کش اندازه گیری کرد و با توجه به جدول همراه دیسک ها ، گزارش تست انتی بیوگرام خود را برای هر یک از انتی بیوتیک ها ، به صورت حساس (Susceptible ) ، مقاوم (Resistant) و یا نیمه حساس (Intermediate) گزارش می شود .